创业中国编辑整理：创业好文章，尽在草根创业网

一.主要设备:(1)工业用离心机一台;(2)恒温水浴锅(10L--50L)(可自制)1台;(3)冰柜1台;(4)搅拌机1台;(5)玻璃器皿:1000ml,500ml烧杯各3只,50ml烧杯 2 只,50ml,500ml量杯各1个;(6)塑料桶若干个。

二.主要试剂:(工业纯度)柠檬酸钠,柠檬酸,葡萄糖,乙醇90%，氯仿,丙酮,氯化钠,磷酸氢二钠,磷酸二氢钠,去离子水或蒸馏水,葡萄糖凝酸胶SephadexG-- 100 和DEAE--纤维素.

三.试剂的配制:

1.抗凝剂配方:(1)柠檬酸钠30g,柠檬酸10g葡萄糖 25g加水至1升,一般此种是每7ml血液,加1ml(抗凝剂).(2)40g/升柠檬酸钠溶液:在1升水中加入0.9克的氯化钠.

2.生理盐水:(0.9%)在91克水中加入0.9克的氯化钠.

3.磷酸盐缓冲溶液的配制:PH7.6,0.2M磷酸盐缓冲溶液,一般用Na2HPO4.H2O,35. 61 克 / 升和NaH2PO4.2H2O 31.21克/升,前者加87.0ml,后者加13.0ml混合后即为PH=7.6 缓冲溶液,如果用K2HPO4.3H2O为45.644g/升,NaH2PO4.2H2O为31.21克/升,仍是前者87.0ml,后者13.0ml混合后即得.

4.冷却剂:在本工艺中有使用-15度低温,一般用如下配方:用33克食盐加入100克雪或碎冰,以此比例配成混合体可达-21.3度。

四.工艺流程

(一)除血红蛋白

1.血液抗凝处理,在新鲜牛,马,猪血中迅速加入ACD1号抗凝剂,并缓慢搅匀,每7毫升血液中加入抗凝剂1毫升或2号抗凝剂.

2.把抗凝处理的血液放入离心机,以3000r/min离心约15--20分钟, 用吸管把上清液(黄色血清)小心吸去抛掉,下层的红血球用2--3倍生理盐水洗2--3次,在每一次洗涤中,用离心机以3000r/min离心,7--8分钟,反复操作后,得到洗涤血红细胞,洗涤后的血红细胞在-15度下冷冻可保存半年并不影响产率和比活,在血液量大, 处理不完时必须这样做.

3.在洗净的红血球中加入等体积去离子水,剧烈搅拌30分钟,使红血球细胞壁砍碎,以使其内的SOD浸出.最好在0--4度静止过夜后,把溶血进行有机提取.

4.接着向溶血中缓缓加入0.2--0.25倍体积的预冷(-15度)95%乙醇和0.1--0.15倍预冷氯仿,搅拌10--15分钟后,原溶血呈浆糊状,静止1--2小时,用滤布除去凝固的血红蛋白,然后将滤液2500r/min离心约1--5分钟留上清液抛去沉淀, 此时如果上清液略为微黄色时,可用快速过滤纸过滤,可得到微带蓝色的清澈透明的粗酶液
 
(二)粗酶液的初步提纯:

1.丙酮提醇:向酶液中加0.8倍量预冷(-15度 ) 丙酮 , 生成大量白色沉淀 , 以3000r/min离心2分钟收集沉淀,上清液可不必吸取,直接倾倒.

2.热变性:(除杂蛋白)准备好衡温浴锅,在本工艺中,提前30分钟, 注满水接通电源后,使之加热到55--60度以省时间,将沉淀量约50倍量体积比加入0.2MPH=7.6磷酸钠缓冲溶液,水浴加热至60度,15分钟后迅速冷却到室温.3000r/min离心2 分钟得上清液,在上清液中,缓缓滴加0.6倍体积的预冷(-15度)丙酮,生成白色沉淀

3.初纯SOD:在上述沉淀中加去离子水,制成20--30%SOD溶液,分装入样品瓶中,放入冷冻干燥机中,于开机后以0.2--0.1Torr真空度,约1.5--2小时, 得到化妆或食品用SOD,该产品比活大于3000u/mg,外观呈微带蓝色的白色冻干品.

(三)SOD进一步提纯:

SOD精品一般是把SOD产品经过柱层析,柱层析后的SOD没有小分子等杂质, 层析后为高活性的SOD大分子.SOD精品价格更高,它主要作为生物化学试剂, 化验室标准试剂试用.目前SOD柱层析有两种,二者可单独使用,也可结合使用,一般是DEAE-- 纤维素层析和SephadcxG--100葡聚糖凝胶层析,将(二)2,热变性后SOD丙酮沉淀用PH7.6,0.2MNaH2PO4-NaHPO4缓冲溶液溶解,有不溶的杂蛋白时.离心抛去沉淀,上清液上DEAE--纤维素或SephadsxG--100层析柱(1*20cm或2.5*30cm),梯度洗脱 , 洗脱液为PH7.6,0.2M,NaH2PO4--NaHPO4缓冲液,下流速度控制在0.2--0.5ml/min,在分光光度计上用紫外谱325nm处测流出液,合并活力峰,再用蒸馏水反复透析,透析彻底后, 放入样品皿置于冷冻干燥机中干燥后即得SOD精品.

五.注意事项:

1.掌握适当的温度和时间:虽然SOD对热较稳定, 但在分离纯化过程中最好还是采用较低温度,一般以0--10度为宜,时间长不要超过3天.

2.注意提取,提纯方法:使用有机溶剂或者加热均能有效沉淀蛋白质, 但掌握适当溶剂和加热结合的办法可以达到最佳效果
六.SOD的检测方法:活性检验,比较方便的办法是用连笨三酚自氧化法, 先测得连笨三酚的自氧化速率,然后加入SOD再测得加入SOD之后的氧化速率,按照酶活性单位定义,即在最佳条件下,每分钟抑制连笨三酚自氧化分解速率达50% 的酶量定义为一个酶单位.依次求出活力总值 ,同时也可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定其纯度,看其分子量32000左右的一条带是否与有关文献指导一致.

超氧化物岐化酶(superoxide dimutase 简称SOD)是一种重要的氧自由基清除剂，作为一种药用酶，引起国内外生化届和医药届的极大关注。SOD应用于医学临床上可以治疗多种疾病，类风湿性关节炎、心肌梗塞等，在防辐射，抗衰老，抗肿瘤等方面也有积极的作用，而且广泛用于化妆品和食品添加剂的行列。

自１９６９年Ｍccord和Ｆridovich 首次发现从牛血细胞中发现超氧化物岐化以来，到目前为止，国内已有几十家科研单位对SOD作了大量的研究和试产工作，而且有些已批量生产。SOD引起了国内生化界的重视，１９８８年在浙江宁波如开了《全国首届SOD学术会议》。1989年4月在河南开封《第三届药用酶学术会议》上，SOD被列为重点开发项目，90年7月在大连《全国第二届SOD学术会议》，SOD已作为一种药用酶发展较快，将成为一种很有前途的生化产物。

SOD是一种广泛存于动物、植物和微生物的生物酶，国外药用SOD系从血中提取，国内SOD已开发的品种已超过２０种，证明我国对SOD的研究和应用已进入新时期。

我国从牛、马、猪、鸡、狗等动物血中提取SOD来源丰富，成本低，提取和纯化较方便，药细胞膜易破，用常规分离纯化法可获得高纯度的SOD。

本技术采用热变性，超滤新技术，不仅大大简化了工艺过程，而且产品质量和收率都比老工艺有较大的提高，其提取的SOD均为ＣuＺu-SOD。

一、药品与仪器：

(１)柠檬酸三钠：Ｎa3Ｃ6Ｈ6Ｏ7 (２)工业丙酮ＣaＨ6Ｏ

(３)邻苯本酚 (４)酸磷钾Ｋ3Ｐoe4

(５)弱碱性阴离子交换剂ＤＥＡＥ Ｓephadsxa-50外观40-120ubrd或者ＤＥＡＥ-cell-ujose(ＤＥ-32)二乙基纤维素。 (６)冷冻干燥器(自己组配)

(７)层折柱(７.５＊３０cm) (８)离心机 
（阅读次数： ）